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KP-N-NS细胞专用培养基的应用!
www.yiqi800.com  2020-10-28 18:01  北京百欧博伟生物技术有限公司

KP-N-NS细胞专用培养基的应用!



一、背景


KP-N-NS细胞专用培养基适用于KP-N-NS细胞各个时期的无菌培养。KP-N-NS细胞专用培养基包含KP-N-NS细胞生长所需的各种物质不需要额外添加血清和其他成分可直接用于KP-N-NS细胞的体外培养。


KP-N-NS细胞是源自脑转移灶的肾上腺神经母细胞瘤洗白呈现 上皮细胞样贴壁生长。


二、KP-N-NS人肾上腺神经母细胞瘤细胞(脑转移)培养操作


1、复苏细胞:将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟弃去上清液补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜(或将细胞悬液加入10cm皿中加入约8ml培养基培养过夜)。第二天换液并检查细胞密度。


2、细胞传代:如果细胞密度达80%-90%即可进行传代培养。

⑴弃去培养上清用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

⑵加1ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培养瓶中,置于37℃培养箱中消化1-2分钟然后在显微镜下观察细胞消化情况若细胞大部分变圆并脱落迅速拿回操作台,轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

⑶按6-8ml/瓶补加培养基轻轻打匀后吸出在1000RPM条件下离心4分钟弃去上清液补加1-2mL培养液后吹匀。

⑷将细胞悬液按1:2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。


3、细胞冻存:待细胞生长状态良好时可进行细胞冻存。下面T25瓶为类;

⑴细胞冻存时弃去培养基后PBS清洗一遍后加入1ml胰酶细胞变圆脱落后加入1ml含血清的培养基终止消化可使用血球计数板计数。

⑵4 min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞根据细胞数量加入血清和DMSO轻轻混匀DMSO终浓度为10%细胞密度不低于1x106/ml, www.yiqi800.com每支冻存管冻存1ml细胞悬液注意冻存管做好标识。

⑶将冻存管置于程序降温盒中放入-80度冰箱2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。


三、应用


用于神经母细胞瘤中肿瘤恶液质及PLK1抑制剂RO3280的功能研究:


神经母细胞瘤中肿瘤恶液质的研究目的:神经母细胞瘤(neuroblastoma,NB)是儿童最常见的颅外实体肿瘤,占儿童肿瘤的10%和儿童肿瘤相关死亡的15%。肿瘤恶液质(cancercachexia,CC)是常见的伴随肿瘤发生的多因素综合征,主要表现为体重减轻、骨骼肌减少。大约50%的肿瘤患者的死亡与肿瘤恶液质相关。


四、方法


1、体内实验:将12只裸鼠随机分为两组,KP-N-NS组6只裸鼠皮下注射KP-N-NS细胞,PBS组6只裸鼠皮下注射等体积PBS;之后监测裸鼠体重及摄食重量,6周后处死存活裸鼠,收集裸鼠骨骼肌、心脏标本,用H&E染色方法观察裸鼠骨骼肌、心肌的变化,用免疫荧光方法检测骨骼肌中肌球蛋白(Myosin)表达水平,用免疫组化方法检测裸鼠骨骼肌中增殖、自噬、泛素化相关蛋白表达水平。


2、体外实验:收集培养过KP-N-NS细胞的培养基作为条件培养基(conditioned medium,CM),用CM(CM组)、Angiogenin(血管生成素)(Angiogenin组)培养C2C12细胞,用正常培养的C2C12细胞作为对照组,观察细胞数量及生存状态。诱导C2C12细胞分化3d,用CM、Angiogenin培养C2C12细胞24h,用免疫荧实验观察C2C12细胞肌管直径变化。用CM培养C2C12细胞15min、30min、1h、24h,提取相应蛋白质,用WesternBlot方法检测增殖、自噬、泛素化相关蛋白表达水平。


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