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微生物检测的生物化学试验汇总!
www.yiqi800.com  2021-01-07 00:00  北京百欧博伟生物技术有限公司

微生物检测的生物化学试验汇总!


百欧博伟生物;利用生物化学的方法来检查这些代谢产物以鉴别细菌的方法称为细菌的生物化学试验简称生化试验。


一、糖类代谢试验


1、糖(醇)类发酵试验

不同细菌含有发酵不同糖(醇)的酶因而发酵糖(醇)的能力各不相同。即使某些能发酵同样的糖(醇)但其产物也不同,有的产酸产气有的产酸不产气可根据这些特点来鉴别细菌。

大致可分为:

液体发酵管:无糖肉汤或蛋白胨水中加入1%糖(醇)类指示剂一支小玻管经灭菌后备用。若被检细菌对营养要求较高时则在试验前加入2%~5%无菌血清。

半固体发酵管:在液体糖(醇)发酵培养基中加入0.3%~0.5%琼脂溶化后分装试管灭菌后让试管直立使琼脂凝固做成高层培养基接种细菌应用接种针穿刺接种。

固体发酵管:此类培养基一般不常用仅用于营养要求较高的某些细菌在含糖类及5%~10%血清琼脂斜面上进行发酵试验。另外固体高层糖发酵管可用于厌氧细菌糖发酵试验如产气荚膜杆菌在含糖的固体高层发酵管中出现汹涌发酵(产生大量气体)。

双糖(或三糖)高层斜面发酵管:这种培养基含有葡萄糖和乳糖(或再加蔗糖)这两种糖(或三种糖)混在一起制成高层斜面其中葡萄糖和乳糖(或蔗糖)比例为1:10。

各种糖(醇)发酵管含糖(醇)的浓度一般为0.5%~1%有时可达2%。经121℃20~30min灭菌容易水解变质特别是在碱性溶液中更易破坏。

故糖(醇)发酵培养基常用高压蒸汽115℃15min灭菌。

应用的糖(醇)种类很多:

单糖:葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、果糖、木胶糖、半乳糖;

双糖:乳糖、麦芽糖、蔗糖、覃糖;

多糖:菊糖、肝糖、糊精、淀粉;

醇:甘露醇、卫矛醇、山梨醇、侧金盏花醇、肌醇、丙三醇(甘油);

糖苷:水杨苷等。

最常用的指示剂有酚红、溴麝香草酚蓝、溴甲酚紫、酸性复红。

前两者颜色反应较敏感但稳定性差后二者比较稳定。特别是一些迟缓发酵的细菌培养时间长应用后二者指示剂。

酚红pH6.8(黄色)~pH8.4(红色)


2、甲基红试验(methyl red)

甲基红指示剂变色范围是pH4.4(红色)~pH6.2(黄色)产气肠杆菌分解葡萄糖产生丙酮酸但又很快将丙酮酸脱羧转化成醇等物质则培养液的pH值仍在6.2以上故此时加入甲基红指示剂培养液呈黄色此为阴性对照菌。阳性对照菌是大肠埃希氏菌呈现红色为阳性。


3、V-P试验

-普试验目的是检查细菌是否能分解葡萄糖产生乙酰甲基甲醇。

阳性对照菌是产气肠杆菌分解葡萄糖(被检细菌接种到葡萄糖蛋白胨水中36℃18~24h)产生丙酮酸再将丙酮酸脱羧形成乙酰甲基甲醇在碱性条件下(乙液-40%KOH溶液)被氧化为二乙酰与培养基蛋白胨中精氨酸等所含的胍基结合通常在10min内形成红色化合物。

若不显色放置于50℃水浴2h或放置于37℃培养箱中4h充分摇动观察培养液反应结果不显红色为阴性阴性对照菌是大肠埃希氏菌。


4、ONPG试验

邻硝基酚-β-D-半乳糖苷的缩写利用该试剂可以检查被检细菌有无β-半乳糖苷酶和渗透酶发酵乳糖的细菌具有这两种酶。

渗透酶将乳糖分子带入菌细胞内而β-半乳糖苷酶可将乳糖的β-半乳糖苷链切断产生葡萄糖和半乳糖。

迟缓发酵乳糖的细菌缺乏渗透酶而ONPG渗入菌细胞内被β-半乳糖苷酶分解产生邻位硝基苯酚一般在20~30min内显黄色为阳性对照菌为枸橼酸盐杆菌和亚利桑那菌。

方法:将被检细菌接种到1%的乳糖肉汤琼脂培养基上37℃培养过夜。取菌苔接种于0.25ml生理盐水中做成悬液。加入1滴甲苯并充分振摇使酶释放。在悬液中再加入ONPG液0.25ml混匀置于37℃培养箱或水浴箱中分别在20min和3h后观察培养液反应结果

不出现黄色者为阴性对照菌是沙门氏菌。


5、氧化发酵试验

测定糖类的氧化或发酵及糖类未被利用的代谢类型。

氧化型:细菌在分解葡萄糖过程中必须有氧分子参加。无氧环境中不能分解葡萄糖。

发酵型:在分解葡萄糖的过程中可以进行无氧降解。发酵型细菌无论在有氧或无氧的环境中都能分解葡萄糖。

产碱型:不分解葡萄糖的细菌。

将待检菌同时穿刺接种两支HL培养基其中一支培养基滴加无菌的液体石蜡油高度不少于1cm37℃培养48h或更长观察反应结果。

培养基变黄色为产酸。

两支培养基均产酸为发酵型细菌仅不加石蜡的培养基产酸的是氧化型细菌两支培养基均不变化的为产碱型细菌。


二、蛋白质、氨基酸及含氮化物代谢试验


1、苯丙氨酸脱氨酶试验

原理:某些细菌具有苯丙氨酸脱氨酶可使苯丙氨酸脱氨形成苯丙酮酸苯丙酮酸与三氯化铁发生螯合作用形成绿色络合物。

方法:将被检细菌的斜面培养物(先增菌)大量移种到苯丙氨酸琼脂斜面上37℃培养18-24h再从斜面上滴加10%三氯化铁溶液4-5滴使其自斜面培养物上缓缓流下观察结果。

结果:溶液出现绿色为阳性对照菌是变形杆菌;不变色为阴性对照菌是产气肠杆菌。


2、脱羧酶试验

原理:某些细菌具有某种氨基酸的脱羧酶可使氨基酸脱去羧基产生胺和二氧化碳胺使pH值>7此时指示剂溴麝香草酚蓝由绿色变为蓝色。

溴麝香草酚蓝酸性显黄色碱性显紫色。

方法:将被检细菌接种到两支脱羧酶培养基中其中一支不加氨基酸另一支加赖氨酸/精氨酸/鸟氨酸再在培养基上覆盖一层灭菌的液体石蜡37℃培养18-24h观察结果。

结果:两管培养基均含有葡萄糖产酸溴麝香草酚蓝由蓝变黄。含有氨基酸的一管出现脱羧基降解作用产生碱性反应溴麝香草酚蓝再由黄变蓝为阳性。

鸟氨酸阴性对照菌为阴沟肠杆菌显黄色。


3、靛基质(吲哚)试验

原理:某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸产生靛基质(吲哚)靛基质与对二甲氨基苯甲醛结合形成玫瑰红色化合物。

方法:将被检细菌接种到胰蛋白胨水培养基中37℃培养24-48h后滴加数滴试剂于培养基液面轻轻摇动(不可剧烈振动)观察结果。

结果:出现红色为阳性对照菌是大肠埃希氏菌;出现黄色为阴性对照菌是产气肠杆菌。


4、硫化氢试验

原理:某些细菌能分解含硫的氨基酸(胱氨酸、半胱氨酸等)产生硫化氢硫化氢与培养基中的铅盐或铁盐反应形成黑色沉淀硫化铅或硫化铁。

方法:将被检细菌以接种针穿刺接种于醋酸铅或双糖铁培养基(乳糖+葡萄糖)中37℃培养24h观察结果。

结果:有黑色出现为阳性。

说明:在硫化氢试验的培养基加入硫代硫酸钠的作用是还原作用以保持培养基处于还原状态是产生的硫化氢不被氧化。

产硫化氢较少的菌种可在试管口放置醋酸铅试条。


5、尿素酶试验

原理:某些细菌具有尿素酶在含有尿素的培养基中分解尿素产生氨使培养基呈碱性此时培养基中的酚红指示剂显红色。

方法:将被检细菌接种的尿素固体斜面培养基上36℃培养4h检查一次再每天检查一次培养5天观察结果。

结果:出现红色为阳性对照菌为变形杆菌;变色为阴性对照菌是大肠埃希氏菌。


三、枸橼酸盐利用试验


1、原理:

枸橼酸盐培养基系一综合性培养基其中枸橼酸钠为碳的唯一来源磷酸二氢铵是氮的唯一来源。

有的细菌能利用枸橼酸钠为碳源能在培养基上生长并且能分解枸橼酸盐最后产生碳酸盐使培养基变为碱性。

培养基中的溴麝香草酚蓝指示剂由绿色变为深蓝色。

不能利用枸橼酸盐为碳源的细菌在该培养基上不生长培养基不变色。

2、方法:

将被检细菌的菌悬液(挑取菌苔后洗至生理盐水中)接种到枸橼酸盐培养基上37℃培养24h观察结果。

3、结果:

培养基上有菌生长培养基变为深蓝色为阳性对照菌是产气肠杆菌;若培养基不变色则继续培养7天培养基仍不变色者为阴性对照菌为大肠杆菌。


四、呼吸酶类试验


1、氧化酶试验

原理:某些细菌具有氧化酶能将二甲基对苯二胺或四甲基对苯二胺试剂氧化(先使细胞色素C氧化电子传递体)成红色醌类化合物。

方法:取白色洁净滤纸蘸取待测菌落加盐酸二甲基对苯二胺溶液1滴;Ewing氏改进法再加α-萘酚溶液1滴。

结果:阳性者立即出现粉红色并逐渐加深变为淡紫色再到深紫色Ewing氏改进法阳性于0.5min内呈现鲜蓝色对照菌为绿脓杆菌(铜绿假单细胞菌);阴性者颜色无变化Ewing氏法阴性为2min内不变色对照菌为大肠杆菌。

1%盐酸二甲基对苯二胺溶液要避免接触含铁物质防止出现假阳性反应。此试剂应少量新鲜配制于冰箱内避光保存也可购置氧化酶试条。

该实验用于分辨革兰氏阴性杆菌中的肠杆菌科(阴性)与弧菌科(阳性)。


2、触酶活力试验

原理:具有触酶的细菌能催化过氧化酶放出生态氧继而形成氧分子出现气泡。

方法:取3%过氧化氢0.5ml滴加到不含血液的被检细菌琼脂培养物上或滴加到不含血液的肉汤培养物中观察结果。

结果:培养物出现气泡者为阳性。

说明:过氧化氢浓度过高(30%)会产生气泡出现假阳性;血液中含有触酶容易出现假阳性。


3、硝酸盐还原试验

原理:某些细菌能将培养基中的硝酸盐还原为亚硝酸盐亚硝酸盐与醋酸作用生成亚硝酸亚硝酸与试剂中的对氨基苯磺酸作用生成重氮苯磺酸再与α-萘胺结合生成N-α-萘胺偶氮苯磺酸(红色)。

方法:将被检细菌接种于硝酸盐培养基中37℃培养1~4天每天吸取培养物2ml加甲液(对氨基苯磺酸0.8g5mol/L醋酸100ml)和乙液(α-萘胺0.5g5mol/L醋酸100ml)各数滴同时以为接种细菌的培养基作对照观察结果。

结果:出现红色为阳性。

说明:亚硝酸盐在自然界分布很广容易污染试剂硝酸盐不纯或保管不妥也可能含有亚硝酸盐因此必须做空白对照;繁殖迅速而还原硝酸盐能力强的细菌如果培养时间过久可能将亚硝酸盐全部分解为氨和氮出现假阴性反应故需每天试验空白对照。


五、毒性酶类试验


1、溶血试验

原理:某些细菌在代谢过程中产生溶血素能使人或动物的红细胞发生溶解。

方法:

1)平板法:将被检细菌接种到血液琼脂平板培养基上37℃培养24h。

2)试管法:取被检细菌16-18h肉汤培养物若干加等量经生理盐水洗涤三次的2%羊红细胞悬液置于37℃水浴箱中30min后观察结果。

结果:

1)平板法:若菌落周围出现透明的溶血环为完全溶血(β溶血)菌落周围出现绿色溶血环为不完全溶血(α溶血)无溶血环为不溶血(γ溶血)。

2)试管法:液体澄清透明为溶血阳性。


2、链激酶试验

原理:A群链球菌在代谢过程中产生链激酶能激活血液中的纤维蛋白酶原为溶纤维蛋白酶促使纤维蛋白凝块溶解。

方法:取血浆0.2ml放入灭菌小试管中加无菌生理盐水0.8ml再加被检细菌18-24h肉汤培养物0.5ml充分混匀后再加入0.25%氯化钙水溶液0.25ml置于37℃水浴中观察结果。

结果:10min内血浆先凝固而后又开始溶解, www.yiqi800.com溶解时间与链激酶含量成正比。链激酶含量多时20min内凝固的血浆完全溶解。如无变化应在水浴中持续2h、24h分别观察结果。血浆凝块完全溶解者为阳性时间越短表明毒性越强。24h血凝块仍不溶解者为阴性。


3、血浆凝固酶试验

原理:某些细菌能产生血浆凝固酶分两种一种结合在细菌细胞壁上遇到血浆直接作用于血浆的纤维蛋白使细菌凝成颗粒状使用玻片法;另一种分泌到细菌细胞外称为游离血浆凝固酶能使血浆中的纤维蛋白原变为纤维蛋白使用试管法试验。

方法:

1)玻片法:取生理盐水2滴分别滴于载玻片上以接种环挑取被检细菌菌落放在2滴生理盐水中研磨成浓菌悬液。在1滴悬液中加1滴未稀释的血浆另一滴加入1滴生理盐水作为对照迅速摇动观察结果。

2)试管法:取3支小试管每支加1:4稀释的新鲜血浆0.5ml,其中1支加被检细菌生理盐水悬液或肉汤培养物0.5ml另一支加阳性菌株生理盐水悬液或肉汤培养物0.5ml作阳性对照再一支加生理盐水或肉汤培养液0.5ml作阴性对照。3支试管置于37℃水浴箱中每隔30min观察一次结果。

结果:

1)玻片法:若在加血浆的1滴中迅速出现凝固颗粒在加生理盐水对照的1滴中未出现凝固颗粒为阳性;若超过2min才开始出现凝固颗粒者不作阳性(多为非致病性)。

2)试管法:6h内若试验管和阳性对照管出现凝固阴性对照管不出现凝固为阳性;多数阳性细菌在0.5-1h内发生凝固。


六、嗜盐试验

原理:在高于3%的氯化钠培养基上不生长或生长不好但能在无言培养基上生长的称为非嗜盐菌如肠杆菌科。能在3%-6%氯化钠培养基上生长但在无盐培养基上不生长称为嗜盐菌如副溶血性弧菌。在无盐和高盐培养基上均能生长但长得不茂盛称为耐盐菌如葡萄球菌、铜绿假单细胞菌。

方法:取被检细菌分别接种到1支无盐葡萄糖蛋白胨水和一支5%-6%氯化钠葡萄糖蛋白胨水中37℃培养6-24h观察生长情况。

结果:培养物出现浑浊生长为阳性。


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