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小鼠气管和支气管组织提取物的应用!
www.yiqi800.com  2021-04-01 18:00  北京百欧博伟生物技术有限公司

小鼠气管和支气管组织提取物的应用!


一、背景


小鼠气管支气管组织提取物分离自小鼠气管和支气管组织可以直接用于基因克隆表达图谱分析以及各种分子生物学实验的研究。气管trachea和支气管bronchi均以软骨、肌肉、结缔组织和粘膜构成。软骨为“C”字形的软骨环缺口向后各软骨环以韧带连接起来,环后方缺口处由平滑肌和致密结缔组织连接,保持了持续张开状态。


管腔衬以粘膜表面覆盖纤毛上皮粘膜分泌的粘液可粘附吸入空气中的灰尘颗粒纤毛不断向咽部摆动将粘液与灰尘排出以净化吸入的气体。气管壁自内向外由粘膜层、粘膜下层及外膜组成。粘膜层有纤毛上皮为假复层纤毛柱状上皮夹有杯状细胞。上皮基膜明显, www.yiqi800.com固有膜内有丰富的弹性纤维、淋巴组织和浆细胞纤毛可向咽喉方向摆动将尘粒与细菌等随粘液一起运到咽经咳嗽反射排出。


粘膜下层为疏松结缔组织内有气管腺开口于粘膜表面上皮和腺体的分泌物是防止尘埃入肺的保护装置分泌物中含有各种免疫球蛋白具有抑菌和抗病毒的作用是机体防御系统的组成部分。外膜由14~16个“C”字形透明软骨环和环间的结缔组织构成软骨环的缺口朝向后面缺口之间有平滑肌束及弹性纤维构成膜性壁。软骨起支架作用有弹性可使管腔保持开放状态以维持呼吸功能的正常进行。平滑肌和弹性纤维可使管壁有一定的舒缩性适于其后方的食管腔内食团顺利下行及颈的俯仰动作。


二、应用


小鼠气管和支气管组织提取物可用于TDI哮喘气道炎性反应中TSLP的作用及其调控机制研究:


1、采用气管滴注的方式进行激发给药,改进TDI哮喘小鼠模型建立的方案,并对模型的建立进行评价。


2、观察TDI哮喘过程中ROR-γt、Foxp3、IL-17A和TSLP基因m RNA表达及其启动子区甲基化变化,探讨TSLP及Th17/Treg细胞平衡在TDI哮喘发病中的作用。


3、观察TSLP中和抗体干预对TDI哮喘的治疗作用以及TSLP与Th17/Treg细胞平衡间的相互作用,探讨TDI哮喘的发病机制。


方法:


1、动物模型的建立选用SPF级健康雄性8-10周龄BALB/c小鼠20只,适应环境1周后,随机分为TDI哮喘组(TDI组)和溶剂对照组(AOO组)。TDI组小鼠于第1、8天耳背分别涂抹20μL 0.3%TDI致敏(溶剂为丙酮:橄榄油=2:3),第15天采用气管滴注法给予20μL 0.01%TDI进行激发(溶剂为丙酮:橄榄油=1:4)。AOO组小鼠,按照上述方法给予等量的溶剂。两组小鼠在同样的饲养条件下饲养并观察小鼠一般生长状况,每天测量小鼠体重。于TDI激发结束后24小时处死小鼠,每组各取6只小鼠检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中细胞总数和细胞分类计数并将BALF中炎细胞涂片,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测BALF白细胞介素4(IL-4)和IFN-γ水平的变化,每组另取4只小鼠多聚甲醛全身灌流固定后取部分肺组织苏木素-伊红(HE)染色观察肺组织病理学改变。


2、TSLP表达及Th17/Treg细胞平衡在TDI哮喘中的变化及其相关基因启动子区甲基化改变模式选用SPF级健康雄性8-10周龄BALB/c小鼠32只,适应环境1周后,随机分为TDI组和AOO组。于TDI激发结束后24小时处死小鼠,每组各取6只小鼠检测BALF中细胞总数和细胞分类计数,每组各取4只多聚甲醛全身灌流固定后取部分肺组织HE染色观察气管和肺组织病理学改变。每组各取6只小鼠部分肺组织,实时荧光定量逆转录RT-PCR和Mass Array飞行质谱法分别检测TDI组和AOO组小鼠肺组织中ROR-γt、Foxp3、IL-17A和TSLP基因mRNA和基因启动子区甲基化水平。


3、TSLP中和抗体干预对小鼠TDI哮喘的保护作用选用SPF级健康雄性8-10周龄BALB/c小鼠48只,适应环境1周后,随机分为TDI组、AOO组和TSLP中和抗体干预组(TSLP中和组),TDI组小鼠于第1、8天耳背分别涂抹20μL0.3%TDI致敏,(溶剂为丙酮:橄榄油=2:3),第15天采用气管滴注法给予20μL 0.01%TDI进行激发(溶剂为丙酮:橄榄油=1:4)。TSLP中和组在激发前30min给予TSLP中和抗体腹腔注射(15mg/kg),AOO组小鼠,按照上述方法给予等量的溶剂。


三组小鼠在同样的饲养条件下饲养并观察小鼠一般生长状况。于TDI激发结束后24小时处死小鼠,每组各取6只小鼠血清检测Ig E水平的变化,同时取肺组织匀浆测IL-4、IFN-γ、IL-13的变化水平,每组各取4只小鼠多聚甲醛全身灌流固定后HE染色观察三组小鼠气管和肺组织病理学改变,每组各取6只小鼠的部分肺组织Western blot检测TSLP蛋白的表达水平,其余部分肺组织用实时荧光定量逆转录RT-PCR法分别检测肺组织中ROR-γt、Foxp3、IL-17A基因m RNA。


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